Комплект за PCR в реално време на вируса Monkeypox

1. ПробаКолекция:Пробата трябва да се събира в стерилни епруветки в съответствие с

със стандартни технически характеристики.

2. Подготовка на реагента (Зона за подготовка на реагента)

Извадете компонентите на комплекта, балансирайте ги на стайна температура за използване в режим на готовност.

3. Обработка на проби (зона за обработка на проби)

3.1 Извличане на нуклеинова киселина

Препоръчва се да се вземат 200 μL течни проби, положителна контрола и отрицателна контрола за екстракция на нуклеинова киселина, съгласно съответните изисквания и процедури на комплекти за екстракция на вирусна ДНК.

3.2 Разтваряне на лиофилизиран прах и добавяне на шаблон

Пригответе лиофилизиран премикс на вируса на маймунската шарка според броя на пробите.Една проба се нуждае от една PCR епруветка, съдържаща лиофилизиран премикс на прах.Отрицателната контрола и положителната контрола трябва да се третират като две проби.

(1) Добавете 15 μL разтвор за разтваряне във всяка PCR епруветка, съдържаща лиофилизиран премикс, след което добавете съответно 5 μL екстрахирани проби/отрицателна контрола/положителна контрола във всяка PCR епруветка.

(2) Покрийте плътно PCR епруветките, разклатете PCR епруветките с ръка, докато лиофилизираният прах се разтвори напълно и се смеси, съберете течността на дъното на PCR епруветките чрез мигновено нискоскоростно центрофугиране.

(3) Ако използвате обикновен PCR инструмент в реално време за откриване, след това директно прехвърлете PCR епруветките в зоната за амплификация;ако използвате BTK-8 за откриване, трябва да изпълните следните операции: прехвърлете 10 μL течност от PCR епруветката в гнездото на реакционния чип на BTK-8.Една PCR епруветка съответства на една ямка на чипа.По време на пипетирането се уверете, че пипетата е вертикална на 90 градуса.Накрайниците на аерозолната бариера на пипетата трябва да се поставят в центъра на ямката с умерена сила и да спрете да натискате пипетата, когато достигне първа предавка (за да избегнете мехурчета).След като ямките се напълнят, извадете мембрана на реакционен чип, за да покриете всички ямки и след това чипът се прехвърля в зоната за откриване на амплификация.

4. PCR амплификация (зона на откриване)

4.1 Поставете PCR епруветките/реакционния чип в реакционния резервоар и задайте имената на всяка реакционна ямка в съответния ред.

4.2 Настройки на флуоресценция за откриване: (1) вирус на маймунска шарка (FAM);(2) Вътрешен контрол (CY5).

4.3 Изпълнете следния цикличен протокол

Протокол на ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Протокол на BTK-8:

5. Анализ на резултатите (моля, вижте ръководството за потребителя на инструмента)

След реакцията резултатите ще се запазят автоматично.Щракнете върху „Анализиране“, за да анализирате и инструментът автоматично ще интерпретира Ct стойностите на всяка проба в колоната с резултати.Отрицателните и положителните резултати от контрола трябва да съответстват на следния "6. Контрол на качеството".

6. Контрол на качеството

6.1 Отрицателна контрола: Няма Ct или Ct>40 в FAM канал, Ct≤40 в CY5 канал с нормална крива на усилване.

6.2 Положителна контрола: Ct≤35 в FAM канал с нормална крива на усилване, Ct≤40 в CY5 канал с нормална крива на усилване.

6.3 Резултатът е валиден, ако са изпълнени всички горепосочени критерии.В противен случай резултатът е невалиден.

Тълкуване на резултата

Възможни са следните резултати:

ЗАБЕЛЕЖКА: Ако се получи невалиден резултат, пробата трябва да се вземе и тества отново.